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Related protocol:
See how to perform ICC staining of epithelial cells cultured at the ALI or as Monolayer Cultures:
https://bit.ly/3kyaEMm
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JKOMOR – Korea Science
2) Transepithelial electrical resistance (TEER) 측정 … LPS를 처리한 실험 시작시점에서 TEER의 측정결과를 … 광도가 높아지는 원리에 의한 것으로, Fig.
Source: www.koreascience.or.kr
Date Published: 8/22/2022
View: 7598
프로그래밍 가능한 출력 주파수를 사용하여 자체 제작 된 볼트 …
TEER 측정 장치는 다양한 실험실 장비 공급업체로부터 쉽게 얻을 수 … 배열되는 시스템이 있지만 4T 측정 원리를 기반으로 하며 동일한 측정 장치와 …
Source: www.jove.com
Date Published: 3/16/2022
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TEER > BRIC
TEER 기계가 너무 오래돼서 측정값이 불안정합니다 혹시 TEER 기계나 electrode를 … 제가 TEER 값을 측정하고 있는데요 현재 24-well을 쓰고 있습니다. caco-2 cell …
Source: www.ibric.org
Date Published: 9/15/2021
View: 7344
식품의약품안전평가원 – ScienceON
활용할 수 있는 방법임. 그림 35. TEER 측정의 원리. – 기관지 상피세포인 calu-3 세포 (seeding : 10만개)를 배양 중 TEER 값을 2일에 한 번 씩.
Source: scienceon.kisti.re.kr
Date Published: 2/18/2022
View: 473
What is TEER? – Axion Biosystems
TEER is a well-established method of evaluating and monitoring epithelial tissue in a non-destructive assay. In particular, the confluence of the monolayer is …
Source: www.axionbiosystems.com
Date Published: 6/30/2022
View: 9796
Journal of the Korean Ophthalmological Society
섬유주를 통한 투과도를 측정하기 위한 또 다른 방법으로 TEER assay를 시행하여 … 에서 전기적 저항이 증가할수록 투과도가 감소하는 원리를 이용한 방법이다.
Source: www.jkos.org
Date Published: 7/17/2022
View: 227
TEER measurement techniques for in vitro barrier model …
Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) is the measurement of electrical resistance across a cellular monolayer and is a …
Source: www.ncbi.nlm.nih.gov
Date Published: 1/8/2021
View: 2431
[석림랩텍] TEER Mesurement Meter EVOM2 – 네이버블로그
조직 배양 연구에서 TEER 측정을 수행하도록 특별히 설계된 제품 – 세포 단층의 상태에 대한 정성 측정 뿐만 아니라 세포 밀집도를 측정함으로써 정량 …
Source: blog.naver.com
Date Published: 2/11/2021
View: 7859
Caco-2 세포에서 커큐민 처리에 의한 IL-1α로 유도된 소장 상피 …
Caco-2 세포 단층의 TJ integrity에 대한 IL-1α의 영향을 FITC-dextran flux와 transepithelial electrical resistance (TEER)를 측정하여 검증하였다.
Source: kmbase.medric.or.kr
Date Published: 12/23/2022
View: 5155
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- Author: STEMCELL Technologies
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- Date Published: 2020. 10. 28.
- Video Url link: https://www.youtube.com/watch?v=tczv1BTEbX0
A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency
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TEER > BRIC
새벽에 가야죠..불효자… 어쨋든~ 질문 있습니다. 제가 TEER 값을 측정하고 있는데요 현재 24-well을 쓰고 있습니다. caco-2 cell line의 전형적인 이론값을 알고 싶어요. 논문을 찾아보면 단위가 ohm*cm2 로 …
What is TEER?
Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER)
Epithelial and endothelial cells form barriers in the body. The strength and integrity of these barriers can be assessed via measurements of the electrical resistance across the cell layer in vitro, called TEER.
TEER is a well-established method of evaluating and monitoring epithelial tissue in a non-destructive assay. In particular, the confluence of the monolayer is quickly determined. The confluence can be tracked and monitored in real-time as the TEER measurement will rise as the gaps in the monolayer close.
TEER is often used with epithelial and endothelial cells in a monolayer as a strong indicator of cell barrier integrity and permeability. These indicators are often used in vitro with evaluating transport of drug chemicals or drug screening assays .
How does TEER work:
Impedance technology is used to measure TEER. A small AC current is passed from one electrode to another. TEER measures how much of this electrical signal is blocked by the cellular layer, thereby quantifying barrier integrity. Because impedance is non-invasive and label-free, the barrier can be continuously monitored for minutes, hours, or even days without disturbing the cellular biology.
Electrodes embedded in the cell culture substrate at the bottom of each well detect small changes in the impedance of current flow. Barriers, such as tight junctions between cells, resist current flow, leading to an increase in TEER measurements of barrier function.
Traditionally, TEER is measured by placing two “chopstick” style electrodes on either side of a transwell insert with a confluent cell layer. Manual methods, where the electrodes are placed well-by-well, are highly labor intensive. Even automated TEER methods are typically constrained to lower throughputs, like 24 well plates but now systems allow measurements of up to 96 wells simultaneously.
Common biological models evaluated with TEER:
Blood-brain barrier
Gastrointestinal tract
Pulmonary models
Organ-on-a-chip
The biological models are often assessed with TEER in order to evaluate drug or chemical transport or diffusion.
Measuring frequencies of electrical resistance:
Traditional TEER measurements require a fully confluent cell layer to accurately measure barrier function. In contrast, newer systems track coverage and TEER simultaneously and continuously by measuring impedance at multiple frequencies.
Measuring impedance at low frequency is highly sensitive to the intercellular barrier formed by tight junctions and the paracellular barrier formed by cell membranes. On the other hand, measurements at higher frequency can be used to quantify coverage of the well bottom. In other words, low frequencies are sensitive to “what” cells are there, whereas high frequencies are sensitive to “how many” cells are there.
Transcript of the What is TEER video
Epithelial tissue is a major building block of many organs, like the skin, lungs, liver, kidney, and digestive tract. Specialized epithelial cells called endothelium comprise the inner lining of blood vessels.
While they may take a variety of forms, epithelial tissues serve an important biological function forming protective barriers throughout the body and regulating what gets in and out. Tightly packed cells attach together with junction proteins that form selectively permeable barriers. When these barriers are disrupted chemically, through injury, or disease, this regulation breaks down leading to a host of adverse effects. Measuring in vitro barrier integrity with TEER is a widely accepted method to quantify and model barrier function.
TEER stands for trans-epithelial electrical resistance. Traditionally TEER is measured by manually placing two chopstick-style electrodes on each side of a confluent cell layer. A low frequency current is applied and the resistance of the barrier is measured. The easier the current flows between the cells the lower the TEER value. This method is typically low throughput and variability can arise from electrode placement, changing environmental factors, and more. A fully confluent layer is required to accurately measure barrier function. By integrating electrodes into the well consistent placement is ensured with the Maestro Z reducing variability. Up to 384 wells are measured simultaneously, hands-free. A fully controlled environment ensures barrier function can be stably monitored for minutes, hours, or days without disturbing the cells automatically.
By measuring at multiple frequencies the Maestro Z can simultaneously track TEER and confluence. Low frequency measurements are sensitive to the barrier properties, while high frequency measurements detect cell confluence over the well bottom. By measuring both, differences in confluence are controlled and accounted for in your analysis. In this example, both Calu-3 and A549 cell lines are of epithelial origin and both cell lines reach full coverage within 24 hours. However, only the Calu-3 line expresses tight junction proteins so it produces a much stronger barrier which stabilizes only after the cells reach confluence. Without measuring confluence it is difficult to know when TEER will be stable. TEER may be used for disease modeling and drug development.
The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator or, CFTR protein, is an anion channel that regulates secretion and absorption in multiple tissues. Discovered for its role in cystic fibrosis where mucous secretion may be disrupted, the channel is stimulated by cyclic AMP production. Upon stimulation, CFTR opens to allow ion transport across the cell membrane resulting in a rapid and substantial drop in TEER. A selective CFTR inhibitor blocks this decrease in a dose-dependent manner confirming CFTR as the underlying mechanism of the response. How could TEER help your research? Learn more about TEER and the Maestro Z at axionbio.com/TEER
Journal of the Korean Ophthalmological Society
JKOS Journal of the Korean Ophthalmological Society J Korean Ophthalmol Soc 0378-6471 2092-9374 Korean Ophthalmological Society 10.3341/jkos.2021.62.7.976 jkos-2021-62-7-976 Original Article 섬유주세포에서 항혈관내피성장인자가 기질금속단백분해효소의 활성에 미치는 영향 Effect of Anti-vascular Endothelial Growth Factor on the Matrix Metalloproteinase Activity in Trabecular Meshwork Cells Park Hyeon Jin 박 현진 MD Shin Jeong Wook 신 정욱 MD Kim Jae Woo 김 재우 MD PhD Department of Ophthalmology, Daegu Catholic University School of Medicine, Daegu, Korea 대구가톨릭대학교 의과대학 안과학교실 Address reprint requests to Jae Woo Kim, MD, PhD Department of Ophthalmology, Daegu Catholic University Hospital, #33 Duryugongwon-ro 17-gil, Nam-gu, Daegu 42472, Korea Tel: 82-53-650-4728, Fax: 82-53-627-0133 E-mail: [email protected] 7 2021 15 7 2021 62 7 976 982 22 02 2021 6 04 2021 18 06 2021 Copyright © 2021 Korean Ophthalmological Society 2021 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/ ) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 목적 섬유주세포에서 항혈관내피성장인자(anti-vascular endothelial growth factor, anti-VEGF)가 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 활성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 대상과 방법 인체의 섬유주세포를 배양한 다음 0.25, 0.50 mg/mL anti-VEGF bevacizumab (BV)을 24시간 노출시킨 다음, carboxyfluorescein을 이용하여 섬유주단층세포층의 투과도를 측정하였고 trans-epithelial endothelial electrical resistance (TEER)를 측정하였다. Western blot으로 MMP-1/-2 단백의 활성을 측정하였으며 Griess assay를 이용하여 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성 정도를 측정하였다. 결과 0.50 mg/mL BV은 carboxyfluorescein의 섬유주단층세포층의 투과도를 유의하게 감소시켰으며(p=0.017) TEER에는 유의한 영향을 미치지 않았다(p=0.308). 0.50 mg/mL BV은 MMP-1/-2 단백의 활성을 각각 유의하게 감소시켰으며(p=0.014, p=0.016), 0.50 mg/mL BV은 NO의 생성을 유의하게 감소시켰다(p=0.023). 결론 Anti-VEGF는 섬유주단층세포층의 투과도를 감소시키며, 이와 동반하여 MMP-1/-2 단백의 활성과 NO의 생성을 감소시키는 작용을 나타낸다. Purpose To investigate the effects of anti-vascular endothelial growth factor (anti-VEGF) on the activity of matrix metalloproteinase (MMP) in human trabecular meshwork cells (HTMC). Methods Primary HTMC cultures were exposed to 0, 0.25, and 0.50 mg/mL anti-VEGF bevacizumab (BV) for 24 hours. The permeability through the trabecular meshwork cell monolayer was assessed using carboxyfluorescein and trans-epithelial endothelial electrical resistance (TEER). The levels of MMP-1/-2 were measured by Western blotting and the production of nitric oxide (NO) was assessed with the Griess assay. Results Bevacizumab at 0.50 mg/mL decreased the permeability of carboxyfluorescein significantly (p = 0.017) and did not affect TEER (p = 0.308). Administration of 0.50 mg/mL BV decreased MMP-1 and MMP-2 activities (p = 0.014, p = 0.016, respectively) and inhibited NO production significantly (p = 0.023). Conclusions Anti-VEGF decreased the permeability through the HTMC monolayer, which was accompanied by decreased MMP-1/-2 activity and limited NO production. Anti-vascular endothelial growth factor Bevacizumab Matrix metalloproteinase Nitric oxide Trabecular meshwork 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 신생혈관생성의 중요한 매개체로서 주로 혈관내피세포에서 발현되는 특이 수용체에 결합하여 내피세포의 증식과 이동, 세포외기질의 분해와 같은 신생혈관생성작용을 나타낸다[1]. VEGF는 당뇨망막병증과 망막정맥폐쇄에 의한 신생혈관을 촉진하는 작용을 나타내는데, 임상적으로 신생혈관 억제 등을 목적으로 항혈관내피성장인자(anti-VEGF)로 만든 약제를 사용하고 있으나 부작용의 하나로 안압상승도 나타날 수 있다[2-4]. VEGF는 혈액뇌장벽의 투과도와 혈관내피세포의 투과도를 증가시키는 작용을 나타내며[5,6], 혈관내피세포와 평활근세포에서 VEGF의 작용기전으로 nitric oxide (NO)가 관여하는 것으로 알려져 있다[7,8]. 또한 안구 내에 조직과 망막혈관내피세포에서도 VEGF는 투과도를 증가시키며 이 과정에서도 NO가 관여한다고 알려져 있다[9,10]. 섬유주는 방수유출로의 조절에 중요한 역할을 하는데, 섬유주를 통한 방수유출로의 저항이 증가되어 개방각녹내장을 유발하는 것으로 알려져 있다[11,12]. 섬유주를 통한 방수 유출에서 섬유주세포는 세포외기질의 대사를 조절하여 섬유주의 저항을 조절함으로써 안압을 유지하는 중요한 역할을 한다[13,14]. VEGF는 세포외기질을 분해하고 조절하는 역할을 하는 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 활성을 증가시키는데, 혈관내피세포에서 MMP-1과 MMP-2의 분비를 증가시키며 평활근세포에서도 MMP의 발현을 증가시킨다[15-17]. 섬유주세포는 혈관내피세포와 평활근세포의 성질을 나타내므로[18] anti-VEGF는 섬유주에서 MMP의 분비를 저하시켜 세포외기질의 축척을 유발하여 섬유주를 통한 방수유출을 저하시킬 가능성이 있을 것이나, 섬유주에서 anti-VEGF가 섬유주의 유출에 미치는 영향과 섬유주를 통한 방수유출을 촉진하는 작용을 나타내는 MMP에 대한 영향은 아직 자세히 밝혀지지 않았다. 이에 따라 본 연구에서는 배양한 사람의 섬유주세포를 이용하여 anti-VEGF가 섬유주의 투과도에 미치는 영향을 알아보고 세포외기질의 대사에 중요한 역할을 하는 MMP-1/-2의 분비에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 대상과 방법 세포배양 및 약물처리 본 연구는 대구가톨릭대학병원 의학윤리심의위원회(Institutional Review Board, IRB)의 승인을 받았고(IRB 승인 번호: CR-19-059-L) 헬싱키선언을 따라 시행되었다. 기존의 안병력이 없는 안구이식에 동의한 50세 환자로부터 안구은행에서 얻은 사후 6시간 이내의 안구에서 전방각에서 섬유주를 벗겨내어 배양접시에 옮긴 후 항생제(antibiotic antimycotic solution containing penicillin, streptomycin and amphotericin B, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (HyClone, Cytiva, Global Life Sciences Solutions USA LLC, Marlborough, MA, USA)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO 2 배양기에서 초대배양하였다. 섬유주세포가 이식된 조직편 주위로 자라 나오는 양상과 형태학적으로 섬유주세포의 특징을 확인한 후 섬유주 조직의 이식편을 제거하고 배양을 계속하였으며 세포가 배양접시에 충만해지면 1:3의 비율로 트립신 처리하여 계대배양하였다. 배양된 세포를 섬유주세포 표지자(fibronectin, lamininm, vimentin)로 확인한 후 동결보존하였다. 실험을 위하여 동결보존한 세포를 해동한 후 배양한 다음 인체의 섬유주세포에 anti-VEGF 제제인 bevacizumab (BV; Avastin®, Genentech, South San Francisco, CA, USA)을 0.25, 0.50 mg/mL의 농도로 24시간 동안 노출시켰다. 이때 BV의 농도는 0.1% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 희석하여 조절하였으며 대조군은 동량의 0.1% FBS가 함유된 DMEM을 사용하였다. MTT assay 세포의 생존에 대한 효과는 3-[4, 5 –dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich, MO, USA) assay를 이용하였으며 세포의 생존 정도는 실험군의 값을 약물처리를 하지 않은 대조군의 비로 나누어 백분율로 나타내었다. Carboxyfluorescein permeability assay Transwell (Pore size 0.3 ❍m, polycarbonate membrane, #3460, Corning Life Sciences, Tewksbury, MA, USA)의 내측 chamber에 세포가 단일 세포층으로 충만하게 자란 것을 확인한 후 BV에 24시간 노출시킨 후 투과도 검사를 시행하였다[19-21]. 내측 chamber에 자라고 있는 세포를 세척한 다음 50 mm carboxyfluorescein (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 노출시키고 노출 2시간 후 외측 chamber로 투과된 carboxyfluorescein의 농도를 532 nm에서 분광형광계(Fluostar Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Germany)로 측정하여 백분율로 나타내었다. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) assay 섬유주를 통한 투과도를 측정하기 위한 또 다른 방법으로 TEER assay를 시행하여 섬유주단층세포층의 저항도를 측정하였는데[22,23] TEER assay는 단층 세포층에서 전기적 저항이 증가할수록 투과도가 감소하는 원리를 이용한 방법이다. 섬유주세포를 내측 chamber에 충만하게 배양한 다음 BV에 24시간 노출시킨 후 TEER을 epithelial voltohmmeter (EVOM [2]; World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 측정하였으며 그 결과를 net value (Ωcm2)로 기록하였다. MMP-1/-2 단백의 활성 측정을 위한 Western blot 단백질 추출에는 RIPA buffer (Thermoscientific, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다. Cell lifter (Corning, Acton, MA, USA)로 세포를 모아 원심 분리하여 상층액을 모아 -80°C에 보관하였다. 단백질량은 BCA protein assay reagent kit (Thermoscientific, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 정량한 샘플을 같은 양으로 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 전기영동한 후 Xcell Surelock (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 니트로셀룰로오스 막(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 1시간 동안 옮긴 다음 막 차단 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 1시간 동안 정치배양하였다. Goat anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated된 이차 항체(Santacruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)를 막 차단 용액에 1:3,000으로 희석하여 처리하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 항체를 반응시킨 막을 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermoscientific, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 Gel Doc XR+ (Bio-rad, Hercules, CA, USA)로 단백의 발현양을 확인하였다. 이때 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase를 internal standard로 사용하였다. Griess assay BV이 섬유주세포에서 내인성 일산화질소의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Griess assay를[24] 시행하여 배지에서의 nitrite 생성량을 측정하였다. 약물처리한 세포 배지에 동량의 Griess 반응액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 섞은 후 96-well plate에 옮겨 NO 생성의 반응물인 아질산염(nitrite)의 양을 spectrophotometer로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이때 표준치를 구하기 위해 sodium nitrite (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 단계적으로 희석하여 사용하였다. 통계적 처리 모든 실험은 3계대에서 5계대 사이의 세포를 이용하였고 각 실험은 3회 반복하였다. 대조군은 약물처리를 하지 않은 군으로 하였으며, 실험군과 대조군의 비교는 unpaired t-test를 사용하였으며 유의수준은 0.05%로 정하여 윈도우용 Primer of Biostatistics (Version 7, McGraw-Hill, Blacklick, OH, USA)를 사용하였다. 결 과 Anti-VEGF가 섬유주의 생존에 미치는 영향 약제에 노출되지 않은 대조군에 비하여 0.25, 0.50 mg/mL BV는 24시간 노출시킨 경우 섬유주세포의 생존에 유의한 영향을 미치지 않았다(p>0.05) ( Fig. 1). 이러한 결과는 2 mg/mL 이하의 저농도 BV는 섬유주세포의 생존에 유의한 영향을 끼치지 않았다는 기존의 결과와 일치하며[25], 본 실험에 사용된 BV의 농도에서 다음의 실험 결과는 섬유주세포의 생존 변화에 의한 것이 아님을 알 수 있다. Anti-VEGF가 섬유주단층세포층의 투과도에 미치는 영향 약제에 노출되지 않은 대조군에 비하여 0.50 mg/mL BV는 carboxyfluorescein의 섬유주단층세포층의 투과도를 유의하게 감소시켰다(p=0.017) ( Fig. 2). 그러나 섬유주단층세포층의 투과성에 대한 저항 정도를 나타내는 TEER을 측정한 결과 0.25 mg/mL, 0.50 mg/mL BV는 농도의 증가에 따라 TEER을 증가시키는 경향을 나타내기는 하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(p=0.616, p=0.308) ( Fig. 3). Anti-VEGF가 MMP 단백 활성에 미치는 영향 약제에 노출되지 않은 대조군에 비하여 0.50 mg/mL BV는 MMP-1 단백의 활성을 유의하게 감소시켰으며(p=0.014) ( Fig. 4), MMP-2 단백의 활성 역시 유의하게 감소시켰다(p=0.016) ( Fig. 5). 그러나 0.25 mg/mL의 BV에 노출시킨 경우에는 약제에 노출되지 않은 대조군에 비하여 MMP-1과 MMP-2 단백의 활성에 각각 유의한 차이를 나타내지 않았다(p=0.189, p=0.109). 이러한 결과는 BV의 농도가 증가할수록 MMP 단백의 활성을 감소시킬 가능성이 있음을 보여주고 있다. BV가 NO의 생성에 미치는 영향 약제에 노출되지 않은 대조군에 비하여 0.25 mg/mL BV는 배지에서 nitrite의 생성에 유의한 영향을 미치지 않았으나(p=0.190), 0.50 mg/mL BV는 배지에서 nitrite의 생성량을 유의하게 증가시켰다(p=0.023) ( Fig. 6). 고 찰 Anti-VEGF는 재조합 단일클론 IgG 항체이며 안구 조직에 미치는 영향은 이미 잘 알려져 있다[17]. 임상적으로 사용되는 농도에서는 anti-VEGF는 독성을 유발하지 않는다는 보고도 있으나 고농도에 노출될 경우 섬유주세포에 대한 독성을 유발할 수 있다[25-28]. 그러나 본 실험에 사용된 저농도의 anti-VEGF는 기존 연구 결과와 마찬가지로 섬유주세포 생존에 유의한 영향을 미치지 않았다[25]. Anti-VEGF 제제의 부작용의 하나로 안압상승이 초래될 수 있는데[2-4], 안압상승의 기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았으나 그 기전의 하나로서 anti-VEGF는 NO의 생성을 억제하는 작용이 있으므로 섬유주에 노출될 경우 방수유출을 억제함으로써 안압상승을 유발하는 기전으로 작용할 가능성이 제시된 바 있다[27]. Anti-VEGF가 방수유출에 미치는 영향을 실험실 내 연구로 알아보기 위하여 시행한 anti-VEGF의 일종인 BV을 사용한 섬유주단층세포층의 투과도검사에서 0.50 mg/mL BV는 carboxyfluorescein의 투과도를 유의하게 감소시켰다. 따라서 anti-VEGF는 농도가 높을수록 섬유주세포의 투과도를 감소시킬 가능성이 있다. 섬유주를 통한 방수유출의 저항을 조절하는 데에 있어서 MMP에 의한 세포외기질의 대사조절이 중요한 역할을 한다. 섬유주세포와 조직에서 다양한 종류의 MMP가 발현되는데 이들 MMP 중 MMP-1, 3, 9은 정상 상태에서는 발현이 미약하나 다양한 자극에 의해 발현이 증가되며, MMP-2는 비교적 많이 발현되는 것으로 알려져 있으므로[13,14] 본 연구에서는 MMP-1과 MMP-2의 발현을 조사하였다. VEGF는 혈관내피세포에서 MMP-1과 MMP-2의 분비를 증가시키며, 평활근세포에서도 MMP의 발현을 증가시키므로[15-17], anti-VEGF는 MMP의 활성을 감소시켜 세포외기질의 대사를 저해함으로써 섬유주의 저항을 증가시킬 가능성이 있으나, 인체의 섬유주세포에서 anti-VEGF가 섬유주세포의 MMP 활성에 미치는 영향은 아직 알려지지 않았다. 이에 따라 시행한 본 연구의 결과에서 BV는 MMP-1/-2의 활성을 각각 억제하였다. 따라서 anti-VEGF의 농도가 증가할수록 MMP 단백의 활성을 저하시켜 세포외기질의 축척을 유발하여 방수유출에 대한 섬유주의 저항을 증가시킬 수 있을 것이다[29,30]. VEGF가 투과도를 증가시키는 기전의 하나로 NO가 관여하는 것으로 알려져 있다[5-9,31]. NO는 섬유주를 이완시켜 방수유출을 증가시키는 작용을 나타내므로[32-34] anti-VEGF가 NO의 생성을 저하시킨다면 방수유출을 저하시킬 수 있을 것이다. MMP는 조직과 병적 상태에 따라 매우 다양한 작용을 나타내는데[35] NO와 MMP의 발현에 관한 상호작용에 대해서는 세포의 종류에 따라 다양한 결과가 보고되어 있으며 NO는 MMP-1의 발현을 촉진하기도 하고 MMP-2의 발현을 억제하기도 한다[36-38]. 이를 규명하기 위하여 BV을 이용하여 NO의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 섬유주에서는 anti-VEGF가 NO의 생성을 억제하는 것으로 나타났으며[27] 이와 동반하여 MMP의 발현이 저하되었다. 이러한 결과로 보아 섬유주세포에서는 NO가 MMP의 발현을 저해할 가능성도 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 MMP-1/-2의 발현에 미치는 영향을 조사하였는데 섬유주에서는 다양한 MMP와 그 저해제가 발현되므로[30,39] 여러 종류의 MMP에 미치는 영향과 NO와 MMP의 상호작용에 대해서는 향후 보다 자세한 연구를 요한다. 조직에서 용액의 투과경로는 세포경유경로와 세포주변 경로를 통해 투과되는데[40], 본 연구에서 BV는 세포주변경로를 통한 투과성을 나타내는 섬유주단층세포층의 carboxyfluorrescein 투과도를 감소시켰으나 섬유주단층세포층의 저항도에는 유의한 영향을 미치지 않았다. 그러나 섬유주에서는 세포주변경로를 통한 방수의 유출은 미미하며 주로 세포경유경로인 거대수포를 통해서 방수가 유출되므로[41-43] BV가 세포주변경로를 통한 유출을 시킨다는 본 연구의 실험실 내 결과는 실제 생체 내 섬유주 조직과의 조건은 다를 수 있다. 또한 두 경로는 서로 밀접하게 연관되어 조절될 뿐만 아니라[10,44] anti-VEGF가 세포경유경로를 통한 투과도를 증가시킨다는 보고도 있으므로[45], anti-VEGF가 세포경유경로에 미치는 영향을 완전히 배제할 수는 없을 것이며 이에 관해서는 향후 보다 자세한 연구를 요한다. 또한 본 실험에서는 임상적으로 사용 중인 BV를 희석하여 사용하였으므로 BV에 함유되어 있는 다양한 첨가물의 영향도 고려할 필요가 있을 것이다. 또한 anti-VEGF를 인체의 유리체내에 주사하는 경우 다양한 기전에 의해 안압이 상승할 수 있는 점도 고려해야 할 것이다[46]. 결론적으로 anti-VEGF는 섬유주세포의 투과도를 감소시켰으며, NO의 생성 저하와 함께 MMP의 분비를 감소시킴을 알 수 있었다. Conflict of Interest The authors have no conflicts to disclose. 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Figure 2. Figure 3. Figure 4. Figure 5. Figure 6.
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Caco-2 세포에서 커큐민 처리에 의한 IL-1α로 유도된 소장 상피세포의 tight junction 투과성 저해 Inhibition of Interleukin-1α-induced Intestinal Epithelial Tight Junction Permeability by Curcumin Treatment in Caco-2 Cells in Caco-2 Cells
김춘영,
소속 상세정보
김춘영 ( Kim Choon-Young ) – 영남대학교 식품영양학과
0613820160260091082 DOI : dx.10.5352/JLS.2016.26.9.1082 KMID :
Abstract
본 연구에서는 염증성 사이토카인 IL-1α가 소장의 tight junction (TJ)의 integrity에 미치는 영향을 평가하고 항염증 효능이 있다고 알려진 curcumin (CCM)이 IL-1α에 의한 TJ 손상 예방효과를 알아보고자 Caco-2 세포 모델을 이용하여 실험하였다. Caco-2 세포 단층의 TJ integrity에 대한 IL-1α의 영향을 FITC-dextran flux와 transepithelial electrical resistance (TEER)를 측정하여 검증하였다. IL-1α를 100 ng/ml의 농도로 Caco-2 세포 단층의 상부에 24시간 동안 처리하였을 때 처리 2시간 이후 FITC-dextran의 flux가 유의적으로 증가하였고, IL-1α 처리시간에 비례하여 상승하였다. 또한 IL-1α의 처리는 TEER 값을 유의적으로 감소시켜 IL-1α에 의한 TJ 손상을 확인할 수 있었다. 반면 CCM의 전처리는 이러한 IL-1α에 의한 TJ 기능 저하를 거의 완전히 예방하는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로 염증성 사이토카인 IL-1α이 TJ의 integrity 조절에 부정적인 영향을 미치며 이는 강황에서 발견되는 CCM 전처리에 의해 효과적으로 억제될 수 있음을 보여준다. 본 연구 결과와 관련되어 TJ 구성단백질 발현 및 작용 기작에 대한 분자세포생물학적 연구와 in vivo 연구가 필요하다.
The intestinal tight junction (TJ) plays an important role as a paracellular barrier. Impaired TJ permeability and enhanced proinflammatory cytokine production are crucial pathophysiological mechanisms in inflammatory bowel diseases (IBDs). Although proinflammatory cytokines, tumor necrosis factor-alpha and interluekin-1 beta, which are markedly increased in IBD patients, have been reported to increase intestinal TJ permeability, the role of interleukin-1 alpha (IL-1α) in the TJ has not been studied. Phytochemicals could prevent proinflammatory cytokine-caused TJ alteration. Curcumin (CCM), a biologically active component of turmeric, has a strong anti-inflammatory activity. The purpose of this study was to elucidate the effect of IL-1α on intestinal epithelial TJ permeability and the role of CCM in IL-1α’s action on TJ in an in vitro intestinal epithelial system, Caco-2 monolayers. The TJ integrity of Caco-2 monolayers was estimated by measuring the flux of FITC-labeled dextran and transepithelial electrical resistance (TEER). Apical IL-1α (100 ng/ml) treatment elevated TJ permeability and suppressed TEER of Caco-2 monolayers. Pretreatment with CCM (20 μM) for 30 min significantly inhibited IL-1α-induced TJ alterations, such as increased TJ permeability and decreased in TEER values. These results demonstrated that IL-1α-induced increases in Caco-2 TJ permeability and CCM blocked the action of IL-1α in the TJ.
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Caco-2 cells; curcumin; interleukin-1α; intestinal epithelial tight junction; permeability
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